Estudio del bombeo de protones (Reporte)

Universidad de Guanajuato

División de Ciencias Naturales y Exactas

Biología Experimental

Enero-Junio 2018  

 ESTUDIO DEL BOBMEO DE PROTONES POR LEVADURAS; EFECTO DE LOS INHIBIDORES EN LA CADENA TRASNPORTADORA DE ELECTRONES Y DESACOPLANTES

 Miranda Gálvez Gabriel Vidblain

OBJETIVOS

Relacionar el consumo de glucosa con los cambios de pH producidos por levaduras a nivel de la cadena transportadora de electrones bajo el efecto de un inhibidor y un desacoplante de  la misma. 

INTRODUCCIÓN

Las ATPasas son una importante familia de enzimas que emplean la energía de la hidrolisis del ATP para transportar solutos en contra de su potencial electroquímico, entre ellas se encuentran las de tipo P, que están implicadas en el bombeo activo de iones a través de las membranas celulares. En plantas y hongos la ATPasa de este tipo que predomina es la H⁺-ATPasa. 

En levaduras, esta misma enzima es crucial para su crecimiento y metabolismo ya que constituyen en mayor medida el sistema de regulación de pH y absorción de nutrientes. La enzima energiza la membrana mediante la expulsión de hidrogeniones, lo que genera un potencial eléctrico de membrana y un gradiente de pH, siendo más positivo y por tanto más ácido en el exterior.  Esto produce un flujo de entrada de nutrientes y salida de aniones, para neutralizar la carga negativa del citosol ingresan iones K⁺ gracias a las proteínas trasportadoras  que también se encuentran en la membrana.

Los dos factores más importantes que regulan la actividad de estas ATPasas son la acidez del medio y la oxidación de la glucosa. El metabolismo de la glucosa modifica las propiedades cinéticas de la enzima mientras que la acidificación del medio durante el crecimiento de la levadura provoca un descenso del pH citosólico y por consecuencia, se activa la enzima con el fin de bombear protones al exterior, liberado así hidrogeniones, responsables de dar al medio el carácter ácido. 

Por otro lado, en la membrana interna de la mitocondria está presente la ATP sintasa, cuya función por el contrario es sintetizar ATP mediante un mecanismo conocido como fosforilación oxidativa, cuyo nombre proviene del hecho de que una molécula de ADP adquiere un fosfato más (se fosforila), simultáneamente con una serie de transferencia de electrones que oxidan distintas moléculas de carácter proteico o lipídico, estos electrones provienen de los hidrógenos originados en ciclo de Krebs. 

Estas moléculas se encuentran formando una cadena  que concluye con el oxígeno, en algunos pasos durante el transporte de electrones se bombean hidrogeniones hacia el espacio intermembranal, los cuales tienen una gran tendencia a regresar al interior o a la matriz mitocondrial y su movimiento representa una forma de energía. Así se genera una fuerza (la fuerza protomotriz) capaz de proveer la energía que requiere la síntesis de ATP aprovechada por la ATP sintasa, misma que forma parte de esta cadena transportadora de electrones. Estas dos enzimas tienen en común el bombeo de protones.

Sin embargo, hay una serie de sustancias que pueden modificar el funcionamiento normal de la fosforilación oxidativa, algunos son capaces de bloquear el transporte de electrones a distintos niveles, otros inhiben las reacciones del sistema fosforilante y algunos otros, desacoplan el sistema impidiendo la formación de ATP. Esto afecta de manera secundaria las condiciones del citosol y en el caso de ser una levadura, la ATPasa intervendrá.  

MATERIAL Y REACTIVOS

• 3 Matraces Erlenmeyer de 250 mL 
• Potenciómetro
• Piseta
• Levadura es suspensión
• Glucosa al 10%
• Micropipeta de 100-1000 µL
• Solución de azida de sodio 400mmol/L
• Solución de 2,4-dinitrofenol 400mmol/L en etanol 

 

PROCEDIMIENTO

1. Dentro de cada matraz Erlenmeyer se depositaron 5 mL de levadura en suspensión, mismos que se diluyeron en 40 mL de agua.
2. Durante un periodo de aproximadamente 20 minutos se midió tres veces el pH de cada uno, lavando el instrumento con agua destilada entre cada medición para evitar errores de medida.
3. Posteriormente al matraz dos se le añadieron 0.2 mL de solución 2,4dinitrofenol y al matraz tres se le añadieron 0.5 mL de solución azida de sodio.
4. Transcurridos 5 minutos se continuó con una cuarta y última medición de pH, esto con el fin de obtener el pH basal en cada condición.
5. Más tarde a cada matraz se le añadieron 5 mL de glucosa 10%.
6. Cada cinco minutos se tomaron datos de pH de cada matraz hasta el minuto 20. Para finalizar se tomaron  datos cada diez minutos hasta el minuto 40. Con estos se construyó una gráfica. 

RESULTADOS

Tabla I. pH registrado de acuerdo al tiempo antes y después de cada condición, asi como el pH basal calculado para cada uno.

Tiempo (min)	Matraz 1	Matraz 2	Matraz 3
0	5.95	5.87	5.84
9	5.69	5.74	5.81
18	3.70	5.72	5.61
	Control	Con dinitrofenol	Con azida
25	5.43	5.43	5.95
Tiempo/ pH basal	5.19	5.69	5.80
5	4.84	4.75	5.90
10	4.37	4.40	5.82
15	4.34	4.51	5.75
20	4.23	4.52	5.73
30	4.16	4.19	5.69
40	4.12	4.17	5.63

Imagen 1; Comportamiento del pH a cada condición. 

DISCUSION

El comportamiento de pH para el ensayo con azida de sodio muestra una línea casi constante, esto se debe a que la azida de sodio es un inhibidor de la cadena transportadora, siendo más específico actúa en el último paso, en el complejo IV. Para comprender bien esto, debemos recordar que la cadena transportadora consta de cinco proteínas o cinco complejos, el complejo uno (NADH deshidrogenasa) toma los electrones en forma de hidrógeno del NADH que, como se mencionó en la introducción, provienen del ciclo de Krebs y los cede al complejo tres (citocromo reductasa) en el proceso transloca o bombea hidrogeniones de la matriz mitocondrial hacia el espacio intermembranal, de manera simultánea el complejo dos (succinato deshidrogenasa) toma los electrones en forma de hidrogeno del FADH y los cede al complejo tres, para este caso no hay bombeo de protones. No obstante, en estos procesos interviene una proteína periférica que se mueve libremente de uno a otro complejo moviendo los electrones. El complejo tres conduce los electrones recibidos al complejo IV por otra proteína “móvil” y en el proceso bombea protones. Finalmente el complejo IV (citocromo oxidasa) acopla los electrones al oxígeno para formar agua y en el proceso libera protones. 

Teniendo esto, si la azida de sodio bloquea este complejo, entonces, se bloquea también el bombeo de protones que resultaba de su actividad. Así, solo los complejos I y III bombearán, lo que significa que habrá pocos hidrogeniones siendo bombeados a comparación de la condición normal, esta disminución de hidrogeniones por lógica no promoverá  el carácter ácido del citosol y por tanto las ATPasas, ya en la membrana celular, no tendrán mucha actividad, es decir, no liberaran los hidrogeniones en exceso del citosol al medio y por consecuente no veremos disminución significativa de pH, tal como sucedió. Sin embargo, sí se observa una ligera variación de pH pero esto no se atribuye a la acción de la azida, sino muy probable por la oxidación de la glucosa en cada célula de levadura. Independientemente de que el complejo IV está bloqueado, la célula continua metabolizando glucosa, bombeando protones en la cadena y sintetizando ATP, claro, a menor proporción. De acuerdo con la literatura, cuando la levadura metaboliza esta azúcar, las  ATPasas sufren cambios cinéticos, en otras palabras, aumentan su afinidad y esto las vuelve activas, expulsando los hidrogeniones que se escapan de la matriz y acidificando el medio. 

Por esta misma razón observamos un descenso de pH en el matraz control, ya que el proceso de oxidación de glucosa hasta cadena transportadora está en pleno funcionamiento y recordemos también, que no todos los protones bombeados desde la matriz reingresan a ella, sino que hay unos que se difundirán a través de la membrana externa, que por cierto es muy permeable, y se depositaran en el citosol activando las ATPasas. 

Finalmente, en el comportamiento del pH para el ensayo con 2,4-dinitrofenol se observa una pendiente bien definida producida por el aumento de hidrogeniones en el medio producto de la actividad de este compuesto a nivel de la cadena transportadora. El 2,4-dinitrofenol  es un desacoplante y tiene como efecto el bloqueo de síntesis de ATP, esto lo logra debido a que se ancla a la membrana interna  justo igual como los complejos antes mencionados, es precisamente este anclaje el que daña las propiedades permeables de la membrana y permite así que los hidrogeniones reingresen a la matriz en mayor medida a través del poro que creó y no a través de la ATP sintasa, sin esta energía protomotriz no se sintetiza ATP. De esta manera la concentración de protones se iguala en ambos medios, pero, por el bombeo continuo de protones, el exterior alcanza en algún punto mayor concentración de hidrogeniones y algunos de los protones escapan de la matriz hacia el citosol por gradiente eléctrico, estos hidrogeniones en exceso entonces son expulsados por la ATPasa y una vez afuera de las células promueven un descenso rápido y significativo de pH, tal como se observa en la gráfica. 

CONCLUSIONES

El consumo de glucosa no solo comprende su oxidación (glucolisis,) sino que otros procesos también intervienen más adelante, como el ciclo de Krebs y la cadena transportadora de electrones, esta última es la responsable de los cambios de pH en el citosol cuando los protones (H⁺) difunden hacia el citosol. Podremos  observar estos cambios experimentalmente ya sea inhibiendo la producción de los mismos o favoreciendo su concentración siempre y cuando sea aplicado a organismos capaces de liberarlos al medio, porque por el contrario, organismos superiores realizan esta regulación con otro tipo de especie químicas a partir de buffers fisiológicos.

COMENTARIOS

Los tiempos de medición difícilmente serían exactos ya que solo había un potenciómetro para satisfacer todos los ensayos de todos los equipos.

Por otra parte, debió haber sido necesario recabar al menos dos datos más para construir la línea basal de los matraces que contenían inhibidor y desacoplante, respectivamente. 

REFERENCIAS

Peña Díaz Antonio, Arroyo Begovich Ángel, Gómez Puyou Armando y Tapia Ibargüegoytia. (2003). Fosforilación oxidativa En Bioquímica. Limusa; México. 228229 pp.   

Peña Antonia y Dreyfus Georges. (1997). La energía del mundo animal: el aprovechamiento de los alimentos En La energía y la vida: bioenergética. Fondo de cultura económica; México. 55-58 pp.

Trujillo del Río Cristina. (2016). Regulación de la H+ -ATPasa de la membrana plasmática de levadura por la proteína quinasa TOR, la proteína fosfatasa Sit4 y la proteína de unión a RNA Ssd1. Universidad Politécnica de Valencia. 2-5 pp.