Producción de piruvato y acetaldehído durante la fermentación (Reporte)

Universidad de Guanajuato

División de Ciencias Naturales y Exactas

Biología Experimental

Enero-Junio 2018  

 PRODUCCIÓN DE PIRUVATO Y ACETALDEHÍDO DURANTE LA FERMENTACIÓN

 Miranda Gálvez Gabriel Vidblain

OBJETIVOS

Observar el camino metabólico que sigue una especie de levadura al someterla a diferentes medios a partir de la identificación química de los productos que generan.

INTRODUCCION

Todas las células cuentan con un mecanismo para degradar glucosa (glucolisis), ya sea parcialmente en dos fragmentos de tres  o dos átomos de carbono cada uno, o bien, hasta CO₂ y H₂O. Cualquiera que sea el resultado, el camino metabólico final siempre conducirá a piruvato antes de continuar por cualquier otro camino. Así, en presencia de oxígeno, el piruvato se oxida a acetil-CoA y continúa a través de ciclo de Krebs y más tarde los electrones generados  de ésta entran a cadena respiratoria, donde dos moléculas de NADH ceden sus hidrógenos al oxígeno, de manera que se forma agua y el NADH se oxida a NAD⁺ para ser nuevamente reutilizado en glucolisis y ciclo de Krebs tantas veces sea necesario, pues su concentración es limitada. Por lo contrario, en ausencia de oxígeno, la célula debe buscar la manera de reoxidar el NADH, de no ser así la glucolisis se detiene y a su vez el ciclo de Krebs,  esta nueva manera de oxidación  se conoce como fermentación.

La fermentación se define como el conjunto de reacciones químicas que sufre una sustancia  orgánica (carbohidratos) por medio de ciertos organismos que trabajan bajas condiciones anaerobias, que generalmente van acompañadas de desprendimiento de gas y  producción de energía. 

Hay muchos tipos de fermentación,  pero los dos más comunes son la fermentación alcohólica y la fermentación láctica, está última produce ácido láctico o también llamado lactato a partir de la reducción del piruvato. Por otra parte, en la fermentación alcohólica,  en lugar de reducirse el piruvato, se reduce el producto de su desacarboxilación, el acetaldehído,  y entonces el producto final es etanol en lugar de lactato.

MATERIAL Y REACTIVOS

• 16 tubos de ensaye de cristal.
• 16 tubos de ensaye de plástico con tapa-rosca.
• Gradilla.
• Probeta de 10 mL
• 1 pipeta Pasteur
• Micro pipetas de 1-100 µL, 0-50 µL y 100-1000 µL  
• Centrifuga
• Balanza analítica
• Incubadora a 37° C
• Cultivo de levadura en solución de fosfato de potasio 50 mM, pH 6.8
• Cultivo de levadura en solución de fosfato de sodio 80 mM
• Glucosa al 0.5%, 1% y 2%
• Hidróxido de amonio concentrado
• Sulfato de amonio granular
• Solución de Nitroprusiato de sodio al 5% 
• Solución saturada de 2-4 dinitriofenilhidrazina
• Solución de NaOH 0.1 M
• Agua destilada
• TCA al 10%

PROCEDEMIENTO

1. En 4 tubos de ensaye de plástico se vertieron 3 mL de cultivo de levadura en solución de fosfato de potasio y 3 mL de glucosa al 2%, se enumeraron y rotularon con la letra K.

2. En 4 tubos de ensaye de plástico se vertieron 3 mL de cultivo de levadura en solución de fosfato de sodio y 3 mL de glucosa al 2%, se enumeraron y rotularon con la letra N.

3. De cada serie: en el tubo 2 se añadieron además 3 mL de malonato, en el tubo 3, por otra parte,  se añadieron 3 mL de aceite mineral, en el tubo 4 se añadieron 3 mL de malonato y a su vez 3 mL de aceite mineral y en el tubo 1 no se añadió algo.

4. Sin agitación previa, todos los tubos  se incubaron a 37° C  dentro de una incubadora por 45 minutos. Transcurrido este tiempo  se añadió a cada tubo 1 mL de TCA al 10% para promover el precipitado de macromoléculas.

5. Con ayuda de una balanza analítica se equilibraron en masa los tubos del mismo número añadiendo agua destilada con una micropepeta según la diferencia entre ellos , quedando así cuatro pares de tubos nivelados , esto con el fin de someterlos a 5000 rpm en la centrifuga por 7 minutos. No obstante, antes del procedimiento se cerraron los tubos y se procuró colocar cada pareja en direcciones opuestas para no causar daño al equipo.

6. Concluida la centrifugación, se extrajo con una pipeta Pasteur el volumen de aceite mineral  de aquellos tubos que lo contenían.

7. Cada sobrenadante restante fue decantado en un tubo plástico nuevo previamente enumerado y rotulado, tal como en la primera parte. El pellet generado se descartó.  Estos ocho nuevos tubos se cerraron y se sometieron  a un baño de agua hirviendo por cinco minutos. 

8. Una vez terminado el paso anterior, de cada tubo se tomó 1 .5 mL, de los cuales  0.5 mL se destinaron para la prueba de acetaldehído y  1 mL para la prueba de piruvato. Lo anterior se hizo con micro pipeta usando punta nueva por cada tubo, esto con la finalidad de conseguir resultados más precisos pues cada uno era diferente en composición. 

 9. Para la prueba de  piruvato se hizo reaccionar dicho mililitro con 0.5 g de amonio granular mediante agitación hasta conseguir la solvatación del sólido. Posteriormente se añadieron 3 gotas de Nitroprusiato de sodio al 5% y se agitó con suavidad. Finalmente, se dejaron deslizar por las paredes del tubo aproximadamente 0.5 mL de hidróxido de amonio concentrado. 

10. Para la prueba de  acetaldehído se hicieron reaccionar los otros 0.5 mL con 0.5 mL de 2-4 dinitrofenilhidrazina. Después de agitarlos un par de segundos, se adicionaron 0.5 mL de NaOH 0.1M.

11. Todo el procedimiento anterior se repetió utilizando Glucosa al 1% y 0.5% respectivamente. 

RESULTADOS

Tabla I. Resultados de cada prueba en cada tubo a cada concentración de glucosa en solución de fosfato de sodio. 

En fosfato de sodio	Tubo 1			Tubo 2			Tubo 3			Tubo 4
% Glucosa	0.5	1	2	0.5	1	2	0.5	1	2	0.5	1	2
Prueba de acetaldehído	+	-	+	+	+	+	+	-	+	+	+	+
Prueba de piruvato	-	-	+	+	-	-	-	-	-	+	-	-

Tabla II. Resultados de cada prueba en cada tubo a cada concentración de glucosa en solución de fosfato de potasio. 

En fosfato de potasio	Tubo 1			Tubo 2			Tubo 3			Tubo 4
% Glucosa	0.5	1	2	0.5	1	2	0.5	1	2	0.5	1	2
Prueba de acetaldehído	-	+	+	+	+	+	-	+	+	-	-	+
Prueba de piruvato	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-

Las coloraciones obtenidas de algunas de las pruebas  de piruvato no son las esperadas con las teóricas así que se asumió negativa la prueba mientras se mantuviera constante dicha coloración.

Fig. 1; Prueba de acetaldehído; arriba a la izquierda glucosa 0.5% en solución de sodio; abajo a la izquierda, glucosa  0.5% en solución de potasio; arriba a la derecha, glucosa al 1% (los primeros cuatro tubos en solución de sodio, el resto  en solución de potasio); abajo a la derecha, glucosa al 2% (los primeros cuatro tubos en solución de sodio, el resto en solución de potasio).

Fig. 2; Prueba de piruvato; arriba a la izquierda glucosa  al 1% (los primeros cuatro tubos en solución de sodio, el resto en solución de potasio);  abajo a la izquierda, glucosa al 2% los primeros cuatro tubos en solución de sodio, el resto en solución de potasio); arriba a la derecha glucosa al 0.5% en solución de potasio; abajo a la derecha, glucosa 0.5% en solución de sodio.

DISCUSION

Primeramente, las coloraciones teóricas no lograron ser apreciadas debido a que algún reactivo no estaba justo en la concentración adecuada, sin embargo es posible deducir cuales pruebas debían ser negativas y cuales positivas según las características físicas y químicas de cada ensayo.

La solución de fosfato de potasio empleada en el experimento tiene pH 6.8  y por tanto esto la vuelve ácida en comparación con la solución de fosfato de sodio, que resulta ser alcalina por la presencia de iones Na⁺ afectando la velocidad de reacción de la piruvato descarboxilasa, enzima que cataliza la producción de acetaldehído a partir de piruvato en condiciones anaerobias, de esta manera se promueve la retención de piruvato en el organismo. De acuerdo a lo anterior, entonces, los tubos que contenían solución de fosfato de sodio y además aceite mineral (3N y 4N) al encontrase con el Nitroprusiato de sodio debieron dar positiva la prueba para piruvato.

Por otra parte, en los casos donde el medio era ácido o básico con presencia de oxígeno (1K, 2K, 1N y 2N), la glucolisis seguía su curso normal incluso hasta ciclo de Krebs y cadena respiratoria, lo que conlleva la utilización de piruvato, por ello que la prueba fue negativa para piruvato en algunos ensayos; sin embargo es posible observar con el paso del tiempo una respuesta positiva en 2K, quizá, por el hecho de que las levaduras continúan con glucólisis produciendo nuevas moléculas de piruvato que reaccionan con el Nitroprusiato, esto solo fue posible al parecer en concentraciones de glucosa al 2% donde la fuente de alimento es basta que no ha terminado de consumirse.

También puede suceder lo anterior porque aunque el tubo 2 se desarrolla bajo condición aerobia la presencia de malonato inhibe la succinato deshidrogenasa, acumulándose citrato, el citrato acumulado inhibe la citrato sintasa, acumulándose acetil-CoA. Los niveles de acetil-CoA elevados inhiben a su vez la piruvato deshidrogenasa, reduciéndose la velocidad de conversión de piruvato en acetil-CoA y por tanto se ve favorecido el aumento de la concentración de piruvato, por esta razón los tubos 2N y 2K deberían ser positivos para piruvato.

Una vez explicado esto, el tubo 4N al estar sometido a condiciones anaerobias, con la presencia del malato como inhibidor de ciclo de Krebs y el medio básico que ralentiza el proceso de fermentación, debió haber sido el más significativo de todos para la prueba de piruvato al bloquear todas la rutas que tenía.

La concentración también tiene un rol muy importante ya que a bajas concentraciones la probabilidad de que el alimento escasee es muy alta, además si se cuentan con bajas fuentes de alimento los productos que se generan también serán bajos, esto puede ocasionar que las pruebas cualitativas no sean significativas para nuestro sentido de la vista.

Ahora bien, si juntamos condiciones acidas con condiciones anaerobias, entonces la piruvato descarboxilasa no se  ralentiza, promoviendo la aparición de acetaldehído por fermentación alcohólica,  los tubos 3K y 4K  entonces deberían haber dado positiva la prueba mientras que el resto de los tubos no. La razón por la que la mayoría de los tubos dieron positiva la prueba es porque la 2,4-dinitrofenilhidrazina puede usarse para detectar cualitativamente los grupos carbonilo de cetonas y aldehídos, grupos funcionales que se encuentran a cualquier nivel de la glucolisis o ciclo de Krebs.

En otras palabras, los tubos  número 1 deberían ser negativos para piruvato y negativos para acetaldehído  sin importar el pH, los tubos número 2 deberían ser positivos para piruvato y negativos para acetaldehído sin importar el pH, los tubos 3 y 4 deberían ser positivos para piruvato en medio básico y los tubos 3 y 4  debería ser positivo para acetaldehído en medio ácido.

CONCLUSIONES

Las condiciones de oxigeno muchas veces obligan a algunos seres vivos a seguir rutas metabólicas como la fermentación pues de alguna u otra manera deben conseguir energía.

El nivel de acidez de un medio puede afectar considerablemente las funciones de ciertas enzimas  de modo que por una de ellas, si resulta ser muy importante, se bloquea la ruta por completo desde el inicio, esto también puede ocurrir si están presentes inhibidores. 

La concentración de glucosa está muy relacionada con el tiempo que demoraran los organismos en agotar la fuente de alimento, mientras más  abunde los organismos permanecerán más tiempo, delo contrario, morirán cuando  se agote.

Referencias:

Magaly Galvis Jacome. (2009). Estudio del proceso de fermentación de glucosa para la producción de bioetanol a partir de levaduras nativas. Universidad industrial de Santander; Bucaramanga, Bogotá.  5-6 pp.   

Peña Díaz Antonio et. al. (2003). Los caminos metabólicos de los carbohidratos En Bioquímica. Noriega; México. 222-224 pp.

G. Marambio Oscar. Test de reconocimiento de aldehídos y cetonas. (2012). Obtenido el 25 de febrero del sitio: https://sites.google.com/site/organicaiii/quimica_organica/quimica-organica-iii-nueva/quimica-organica-iii-2009-2012/test-analisis-funcional-2011/e7-e8_2011/e7_2011

Detección de intermediarios en la fermentación alcohólica por levaduras. (s/f). Obtenido el 25 de Febrero del sito: http://cdigital.dgb.uanl.mx/la/1020111465/1020111465_031.pdf