Universidad de Guanajuato
División de Ciencias Naturales y Exactas
Biología Experimental
Enero-Junio 2018
PRODUCCIÓN DE PIRUVATO Y ACETALDEHÍDO DURANTE LA FERMENTACIÓN
Miranda Gálvez Gabriel Vidblain
OBJETIVOS
Observar el camino metabólico que
sigue una especie de levadura al someterla a diferentes medios a partir de la
identificación química de los productos que generan.
INTRODUCCION
Todas las células cuentan con un
mecanismo para degradar glucosa (glucolisis), ya sea parcialmente en dos
fragmentos de tres o dos átomos de
carbono cada uno, o bien, hasta CO2 y H2O. Cualquiera que
sea el resultado, el camino metabólico final siempre conducirá a piruvato antes
de continuar por cualquier otro camino. Así, en presencia de oxígeno, el
piruvato se oxida a acetil-CoA y continúa a través de ciclo de Krebs y más
tarde los electrones generados de ésta entran
a cadena respiratoria, donde dos moléculas de NADH ceden sus hidrógenos al
oxígeno, de manera que se forma agua y el NADH se oxida a NAD+ para
ser nuevamente reutilizado en glucolisis y ciclo de Krebs tantas veces sea
necesario, pues su concentración es limitada. Por lo contrario, en ausencia de
oxígeno, la célula debe buscar la manera de reoxidar el NADH, de no ser así la
glucolisis se detiene y a su vez el ciclo de Krebs, esta nueva manera de oxidación se conoce como fermentación.
La fermentación se define como el
conjunto de reacciones químicas que sufre una sustancia orgánica (carbohidratos) por medio de ciertos
organismos que trabajan bajas condiciones anaerobias, que generalmente van
acompañadas de desprendimiento de gas y producción
de energía.
Hay muchos tipos de fermentación,
pero los dos más comunes son la
fermentación alcohólica y la fermentación láctica, está última produce ácido
láctico o también llamado lactato a partir de la reducción del piruvato. Por
otra parte, en la fermentación alcohólica,
en lugar de reducirse el piruvato, se reduce el producto de su
desacarboxilación, el acetaldehído, y
entonces el producto final es etanol en lugar de lactato.
MATERIAL Y REACTIVOS
- 16 tubos de ensaye de cristal.
- 16 tubos de ensaye de plástico con tapa-rosca.
- Gradilla.
- Probeta de 10 mL
- 1 pipeta Pasteur
- Micro pipetas de 1-100 µL, 0-50 µL y 100-1000 µL
- Centrifuga
- Balanza analítica
- Incubadora a 37° C
- Cultivo de levadura en solución de fosfato de potasio 50 mM, pH 6.8
- Cultivo de levadura en solución de fosfato de sodio 80 mM
- Glucosa al 0.5%, 1% y 2%
- Hidróxido de amonio concentrado
- Sulfato de amonio granular
- Solución de Nitroprusiato de sodio al 5%
- Solución saturada de 2-4 dinitriofenilhidrazina
- Solución de NaOH 0.1 M
- Agua destilada
- TCA al 10%
PROCEDEMIENTO
1. En 4 tubos de ensaye de plástico
se vertieron 3 mL de cultivo de levadura en solución de fosfato de potasio y 3 mL
de glucosa al 2%, se enumeraron y rotularon con la letra K.
2. En 4 tubos de ensaye de plástico
se vertieron 3 mL de cultivo de levadura en solución de fosfato de sodio y 3 mL
de glucosa al 2%, se enumeraron y rotularon con la letra N.
3. De cada
serie: en el tubo 2 se añadieron además 3 mL
de malonato, en el tubo 3, por otra parte, se añadieron 3 mL de aceite mineral, en el tubo 4 se añadieron 3 mL de
malonato y a su vez 3 mL de aceite mineral y en el tubo 1 no se añadió algo.
4. Sin agitación previa,
todos los tubos se incubaron a 37°
C dentro de una incubadora por 45
minutos. Transcurrido este
tiempo se añadió a cada tubo 1 mL de TCA
al 10% para promover el precipitado de macromoléculas.
5. Con ayuda de una balanza analítica se equilibraron en masa
los tubos del mismo número añadiendo agua destilada con una micropepeta según
la diferencia entre ellos , quedando así cuatro pares de tubos nivelados , esto
con el fin de someterlos a 5000 rpm en la centrifuga por 7 minutos. No obstante, antes
del procedimiento se cerraron los tubos y se procuró colocar cada pareja en
direcciones opuestas para no causar daño al equipo.
6. Concluida la centrifugación, se
extrajo con una pipeta Pasteur el volumen de aceite mineral de aquellos tubos que lo contenían.
7. Cada sobrenadante restante fue
decantado en un tubo plástico nuevo previamente enumerado y rotulado, tal como
en la primera parte. El pellet generado se descartó. Estos ocho nuevos tubos se cerraron y se
sometieron a un baño de agua hirviendo
por cinco minutos.
8. Una vez terminado el paso anterior, de cada tubo se tomó 1
.5 mL, de los cuales 0.5 mL se
destinaron para la prueba de acetaldehído y
1 mL para la prueba de piruvato. Lo anterior se hizo con micro pipeta
usando punta nueva por cada tubo, esto con la finalidad de conseguir resultados
más precisos pues cada uno era diferente en composición.
9. Para la prueba de
piruvato se hizo reaccionar dicho
mililitro con 0.5 g de amonio granular mediante agitación hasta conseguir la
solvatación del sólido. Posteriormente se añadieron 3 gotas de Nitroprusiato de
sodio al 5% y se agitó con suavidad. Finalmente, se dejaron deslizar por las
paredes del tubo aproximadamente 0.5 mL de hidróxido de amonio concentrado.
10. Para la prueba de
acetaldehído se hicieron reaccionar los otros 0.5 mL con 0.5 mL de 2-4
dinitrofenilhidrazina. Después de agitarlos un par de segundos, se adicionaron
0.5 mL de NaOH 0.1M.
11. Todo el procedimiento anterior se repetió utilizando Glucosa al 1% y 0.5% respectivamente.
RESULTADOS
Tabla I. Resultados de cada prueba en cada tubo a cada
concentración de glucosa en solución de fosfato de sodio.
En
fosfato de sodio
|
Tubo 1
|
Tubo 2
|
Tubo 3
|
Tubo 4
|
||||||||
% Glucosa
|
0.5
|
1
|
2
|
0.5
|
1
|
2
|
0.5
|
1
|
2
|
0.5
|
1
|
2
|
Prueba de acetaldehído
|
+
|
-
|
+
|
+
|
+
|
+
|
+
|
-
|
+
|
+
|
+
|
+
|
Prueba de piruvato
|
-
|
-
|
+
|
+
|
-
|
-
|
-
|
-
|
-
|
+
|
-
|
-
|
Tabla II. Resultados de cada prueba en cada tubo a cada
concentración de glucosa en solución de fosfato de potasio.
En
fosfato de potasio
|
Tubo 1
|
Tubo 2
|
Tubo 3
|
Tubo 4
|
||||||||
% Glucosa
|
0.5
|
1
|
2
|
0.5
|
1
|
2
|
0.5
|
1
|
2
|
0.5
|
1
|
2
|
Prueba de acetaldehído
|
-
|
+
|
+
|
+
|
+
|
+
|
-
|
+
|
+
|
-
|
-
|
+
|
Prueba de piruvato
|
-
|
-
|
-
|
-
|
-
|
-
|
-
|
-
|
-
|
-
|
-
|
-
|
Las coloraciones obtenidas de
algunas de las pruebas de piruvato no
son las esperadas con las teóricas así que se asumió negativa la prueba
mientras se mantuviera constante dicha coloración.
Fig. 1; Prueba de acetaldehído;
arriba a la izquierda glucosa 0.5% en solución de sodio; abajo a la izquierda,
glucosa 0.5% en solución de potasio;
arriba a la derecha, glucosa al 1% (los primeros cuatro tubos en solución de
sodio, el resto en solución de potasio);
abajo a la derecha, glucosa al 2% (los primeros cuatro tubos en solución de
sodio, el resto en solución de potasio).
Fig. 2; Prueba de piruvato; arriba
a la izquierda glucosa al 1% (los
primeros cuatro tubos en solución de sodio, el resto en solución de
potasio); abajo a la izquierda, glucosa
al 2% los primeros cuatro tubos en solución de sodio, el resto en solución de
potasio); arriba a la derecha glucosa al 0.5% en solución de potasio; abajo a
la derecha, glucosa 0.5% en solución de sodio.
DISCUSION
Primeramente, las coloraciones
teóricas no lograron ser apreciadas debido a que algún reactivo no estaba justo
en la concentración adecuada, sin embargo es posible deducir cuales pruebas
debían ser negativas y cuales positivas según las características físicas y
químicas de cada ensayo.
La solución de fosfato de potasio
empleada en el experimento tiene pH 6.8 y por tanto esto la vuelve ácida en
comparación con la solución de fosfato de sodio, que resulta ser alcalina por
la presencia de iones Na+ afectando la velocidad de reacción de la
piruvato descarboxilasa, enzima que cataliza la producción de acetaldehído a
partir de piruvato en condiciones anaerobias, de esta manera se promueve la
retención de piruvato en el organismo. De acuerdo a lo anterior, entonces, los
tubos que contenían solución de fosfato de sodio y además aceite mineral (3N y
4N) al encontrase con el Nitroprusiato de sodio debieron dar positiva la prueba
para piruvato.
Por otra parte, en los casos
donde el medio era ácido o básico con presencia de oxígeno (1K, 2K, 1N y 2N),
la glucolisis seguía su curso normal incluso hasta ciclo de Krebs y cadena
respiratoria, lo que conlleva la utilización de piruvato, por ello que la
prueba fue negativa para piruvato en algunos ensayos; sin embargo es posible
observar con el paso del tiempo una respuesta positiva en 2K, quizá, por el
hecho de que las levaduras continúan con glucólisis produciendo nuevas
moléculas de piruvato que reaccionan con el Nitroprusiato, esto solo fue
posible al parecer en concentraciones de glucosa al 2% donde la fuente de
alimento es basta que no ha terminado de consumirse.
También puede suceder lo anterior
porque aunque el tubo 2 se desarrolla bajo condición aerobia la presencia de
malonato inhibe la succinato deshidrogenasa, acumulándose citrato, el citrato
acumulado inhibe la citrato sintasa, acumulándose acetil-CoA. Los niveles de
acetil-CoA elevados inhiben a su vez la piruvato deshidrogenasa, reduciéndose
la velocidad de conversión de piruvato en acetil-CoA y por tanto se ve
favorecido el aumento de la concentración de piruvato, por esta razón los tubos
2N y 2K deberían ser positivos para piruvato.
Una vez explicado esto, el tubo
4N al estar sometido a condiciones anaerobias, con la presencia del malato como
inhibidor de ciclo de Krebs y el medio básico que ralentiza el proceso de
fermentación, debió haber sido el más significativo de todos para la prueba de
piruvato al bloquear todas la rutas que tenía.
La concentración también tiene un
rol muy importante ya que a bajas concentraciones la probabilidad de que el
alimento escasee es muy alta, además si se cuentan con bajas fuentes de
alimento los productos que se generan también serán bajos, esto puede ocasionar
que las pruebas cualitativas no sean significativas para nuestro sentido de la
vista.
Ahora bien, si juntamos
condiciones acidas con condiciones anaerobias, entonces la piruvato
descarboxilasa no se ralentiza,
promoviendo la aparición de acetaldehído por fermentación alcohólica, los tubos 3K y 4K entonces deberían haber dado positiva la
prueba mientras que el resto de los tubos no. La razón por la que la mayoría de
los tubos dieron positiva la prueba es porque la 2,4-dinitrofenilhidrazina
puede usarse para detectar cualitativamente los grupos carbonilo de cetonas
y aldehídos, grupos funcionales que se encuentran a cualquier nivel de la
glucolisis o ciclo de Krebs.
En otras palabras, los tubos número 1 deberían ser negativos para piruvato
y negativos para acetaldehído sin importar
el pH, los tubos número 2 deberían ser positivos para piruvato y negativos para
acetaldehído sin importar el pH, los tubos 3 y 4 deberían ser positivos para
piruvato en medio básico y los tubos 3 y 4
debería ser positivo para acetaldehído en medio ácido.
CONCLUSIONES
Las condiciones de oxigeno muchas
veces obligan a algunos seres vivos a seguir rutas metabólicas como la
fermentación pues de alguna u otra manera deben conseguir energía.
El nivel de acidez de un medio
puede afectar considerablemente las funciones de ciertas enzimas de modo que por una de ellas, si resulta ser
muy importante, se bloquea la ruta por completo desde el inicio, esto también
puede ocurrir si están presentes inhibidores.
La concentración de glucosa está
muy relacionada con el tiempo que demoraran los organismos en agotar la fuente
de alimento, mientras más abunde los
organismos permanecerán más tiempo, delo contrario, morirán cuando se agote.
Referencias:
Magaly Galvis Jacome. (2009).
Estudio del proceso de fermentación de glucosa para la producción de bioetanol
a partir de levaduras nativas. Universidad industrial de Santander;
Bucaramanga, Bogotá. 5-6 pp.
Peña Díaz Antonio et. al. (2003).
Los caminos metabólicos de los carbohidratos En Bioquímica. Noriega; México. 222-224 pp.
G. Marambio Oscar. Test de
reconocimiento de aldehídos y cetonas. (2012). Obtenido el 25 de febrero del
sitio: https://sites.google.com/site/organicaiii/quimica_organica/quimica-organica-iii-nueva/quimica-organica-iii-2009-2012/test-analisis-funcional-2011/e7-e8_2011/e7_2011
Detección de intermediarios en la
fermentación alcohólica por levaduras. (s/f). Obtenido el 25 de Febrero del
sito: http://cdigital.dgb.uanl.mx/la/1020111465/1020111465_031.pdf
